液相色譜柱選擇的方法和條件
①填料基質(zhì)
a.硅膠基質(zhì):純度高本錢低,強(qiáng)度大,化學(xué)修飾輕易,但pH值范圍有限。大多硅膠基質(zhì)填料在pH2-8之間穩(wěn)定,但經(jīng)過特殊修飾的硅膠鍵合相可以穩(wěn)定在pH1.5-10。
b.聚合物基質(zhì):應(yīng)用pH值范圍寬,溫度穩(wěn)定(高溫可以達(dá)到80度以上),機(jī)械強(qiáng)度小。
②顆粒外形
大多現(xiàn)代HPLC填料都是球形顆粒,但有時(shí)是不規(guī)則的顆粒。球形顆粒提供較低的柱壓、較高的柱效和穩(wěn)定性以及較長的柱壽命在使用高粘度的活動相時(shí);不規(guī)則顆粒有較大比表面積和相對低廉的價(jià)格。
③顆粒粒徑
粒徑越小柱效越高、分離度越高,但同時(shí)會導(dǎo)致較高柱壓降。選擇1.5-3μm的填料以解決一些復(fù)雜樣品,UPLC可以使用1.5μm的填料;另外10μm或更大粒徑的填料用作半制備或制備柱。
④含碳量
含碳量指的是硅膠表面鍵合相的比例,與比表面積和鍵合覆蓋度等有關(guān)。高含碳量進(jìn)步柱容量、分辨率及分析時(shí)間,用于要求高分離度的復(fù)雜樣品;低含碳量分析時(shí)間短、展現(xiàn)不同的選擇性,用于快速分析簡單樣品及需要高含水活動相條件的樣品。一般C18的含碳量在7-19%不等。
⑤孔徑和比表面積
HPLC吸附介質(zhì)是多孔的顆粒,盡大多數(shù)的反應(yīng)表面于孔內(nèi)。因此,分子必須進(jìn)進(jìn)孔內(nèi)才能被吸附和分離。
孔徑和比表面積是相輔相成的兩個(gè)概念。孔徑小比表面積大,反之亦然。比表面積大,增加樣品與鍵合相之間的反應(yīng),增加保存,上樣量和復(fù)雜成分的分離度;比表面積小,平衡時(shí)間快,適合梯度分析。
⑥孔容和機(jī)械強(qiáng)度
孔容,又稱“孔體積”。指單位顆粒的空隙體積大小。它能很好的反應(yīng)填料的機(jī)械強(qiáng)度。孔體積大的填料相對孔體積小的填料機(jī)械強(qiáng)度要略弱。孔體積為1.5mL/g或更小的填料大多用于HPLC分離,而孔體積大于1.5mL/g的填料使用于尺寸排阻色譜和低壓色譜。
⑦封端封端
封端能夠降低極性堿性化合物由于與裸露的硅醇基相互作用而產(chǎn)生的拖尾峰。不封端鍵合相相對封端鍵合相會產(chǎn)生不同的選擇性,尤其是極性樣品。
液相色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法
色譜柱在使用中常見的問題就是柱壓升高,如果柱壓是在長時(shí)間使用過程中緩慢增加,屬于正常現(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高(系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外),可能的原因有如下幾點(diǎn):
(1)色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染;
(2)色譜柱頭的填料被樣品污染;
(3)色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑,形成結(jié)晶析出;
(4)流動相pH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。
解決辦法如下:
(1)如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,或者卸下色譜柱頭,將其放在10%的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,后再用純水超聲10分鐘,重新裝入色譜柱。
(2)如確定色譜柱頭的填料被污染,將柱頭螺絲卸下,挖出柱內(nèi)前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔細(xì)修復(fù)后,重新安裝上柱頭螺絲。
(3)如確定定是鹽結(jié)晶,用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解,再換高濃度甲醇。
(4)如果因pH值使用不當(dāng),很難恢復(fù)。